CONTAGEM DE MICRORGANISMOS

Existem várias condições em que é conveniente quantificar a população microbiana de uma determinada amostra. Na análise da eficiência de agentes antimicrobianos ou a eficácia de práticas higiênco-sanitárias é comum determinar a população sobrevivente ao tratamento. Também, em determinadas condições clínicas, como em infecções do trato urinário, quando o número de um determinado organismo é superior a 100 mil/ml considera-se que esse organismo é o agente da infecção. Também é comum empregar técnicas para quantificar a população de microrganismos da água e alimentos para avaliar a qualidade microbiológica dos mesmos. 
Os microrganismos podem ser quantificados de forma direta, contando-se  microscopicamente o número de células presentes num determinado material ou superfície, ou indiretamente, efetuando-se análises da turbidez, determinação do peso seco, concentração de substâncias químicas (proteínas, pesquisa de determinada enzima ou produto final de uma via metabólica, DNA, RNA) ou através da contagem do número de microrganismos viáveis utilizando um meio de cultura apropriado. Essa possibilidade permite que se avalie a quantidade de microrganismos na água, em alimentos como leite, carnes, vegetais, superfícies, ar ou até mesmo em culturas puras.
Contagem microscópica direta – esse método requer o uso de câmaras de contagem especiais como a de Petroff-Hauser, na qual uma alíquota de uma suspensão da cultura ou de qualquer amostra é contada e o número de células é determinado matematicamente. O método é rápido mas não permite discriminar células vivas de células mortas. Também não é sensível o suficiente para determinação de populações inferiores a 1 milhão de células. 

Contagem eletrônica – quantifica rapidamente o número de células numa suspensão, através da passagem do fluido por um orifício minúsculo contendo um fluxo de elétrons. Como as células não são condutoras, elas aumentam a resistência elétrica do fluido condutor e a resistência é registrada eletronicamente, quantificando o número de células que passam através do orifício. Esse método tem o inconveniente de detectar células mortas e também quantifica materiais inertes porventura presentes na amostra. 

Análise espectrofotométrica – a turbidez de uma cultura está relacionada com a concentração de células. Quanto mais turva a cultura, maior é a concentração celular. O método turbidimétrico mede a quantidade de luz transmitida no espectrofotômetro a 600m. Quanto menor for a quantidade de luz transmitida maior é a concentração celular daquela suspensão. 
Todos esses métodos podem ser usados para contagem dos microrganismos. Alguns têm aplicações específicas, como a contagem do número de microrganismos no leite ou numa cultura pura. No entanto, em determinadas circunstâncias, como aquelas em que se avalia as práticas higiênico-sanitárias ou processamento tecnológico ou conservação, é preciso determinar a população de células viáveis. Para efetuar a contagem total de bactérias numa determinada suspensão da amostra faz-se diluições decimais seriadas da amostra e inocula-se, usualmente, pela técnica de “pour plate” ou disseminação com alça de Drigalsky, em meios de cultura apropriados. Após o período de incubação em condições de temperatura e atmosfera adequadas faz-se a contagem do número de colônias. Ë preciso, no entanto, tomar determinadas medidas para evitar interpretações errôneas, tais como período em que é colhida a amostra, transporte apropriado, tempo transcorrido entre a coleta e a análise, dentre outros. Nesse método é conveniente preparar as amostras no mais curto intervalo de tempo para evitar a multiplicação dos microrganismos. Por ser este último método o mais empregado na rotina é o que demonstraremos na prática. 

Determinação do número de células viáveis, contagem total de microrganismos viáveis ou contagem padrão em placas ou ainda contagem de viáveis em placa.     

Distribuição dos reagentes para execução da contagem padrão em placas pela técnica de Pour-plate:

Tubos 	1	2	3	4	5	6	
Sol. Salina-peptonada	225ml	9,0	9,0	9,0	9,0,		

Desprezar 1,0 ml

Amostra (água, cultura, etc)

Total da Mistura sucessiva 	25g/ml	

10,0	

10,0	

10,0	

10,0	1,0

-	

Diluição final	1/10	1/100	1/1000	1/10000	1/100000		
	10-1	10-2	10-3	10-4			

Figura 29.

A partir de cada diluição utiliza-se 1,0 ml como inóculo, em duplicata, e distribui-se nas placas previamente esterilizadas. Em seguida, pega-se o meio fundido e esfriado a 45oC (em Banho-Maria) e verte-se sobre a placa de Petri contendo a suspensão diluída da amostra. O material é homogeneizado girando-se a placa através de movimentos circulares no sentido horário e anti-horário ou efetuando-se movimento descrevendo-se o número oito. Esses movimentos são efetuados por cerca de 10 vezes. Após a solidificação do meio, as placas tampadas são invertidas e incubadas em estufas na temperatura e atmosfera apropriadas. Ao final da incubação, usualmente 48 horas, as colônias são contadas e o resultado médio de cada diluição é registrado e multiplicado pelo fator da diluição, que é a recíproca da diluição. As placas adequadas para contagem devem ter entre 30 a 300 colônias. Exemplo, 100 colônias na diluição 1/100, o resultado é 10.000 UFC/ml ou grama da amostra. Usualmente o resultado final é registrado em UFC que significa unidades formadoras de colônias isto porque em algumas situações não é uma única célula que dá origem a uma colônia, mas um agregado de células. 
O método sofre uma ligeira variação quando aplicado para outras contagens. Para contagem de Staphylococcus aureus de uma amostra de alimento o método de semeadura usado é o da disseminação, em que da diluição 1/1;0 ou 10-1retira-se três alíquotas de 0,3 ml e uma de 0,1 ml e verte-se cada uma sobre quatro placas de Petri contendo o meio de cultura Agar Baird-Parker. Cada alíquota é espalhada com auxílio de uma alça de Drigalsky previamente esterilizada em álcool a 70 – 85 % e ligeiramente flambada na chama do bico de Bunsen. As placas são invertidas e incubadas a 35oC por 48horas. As placas contendo entre 25 a 250 colônias típicas são selecionadas e contadas. Supondo as contagens entre 89, 75, 85 e 25 colônias, respectivamente, para as alíquotas 0,3, 0,3, 0,3, e 0,1, a contagem total é de 274 UFC, multiplicada pelo fator de diluição 10, temos 2740 UFC ou 2,74 X 103 UFC/g ou ml da amostra. Caso as placas das alíquotas de 0,3 ml apresentem mais de 300 colônias cada uma, conta-se as colônias da placa contendo a alíquota de 0,1 ml e multiplica-se por 100 ou 102. Exemplo 120 colônias multiplicadas por 100 é igual a 12000UFC ou 1,2 X 104 UFC de Staphylococcus aureus por grama ou mililitro da amostra. Este resultado ainda depende da confirmação de cerca de 10% das colônias pela prova da coagulase. Se todas forem positivas mantém-se o valor, caso contrário, calcula-se o valor fazendo uma regra de três simples.

As vantagens da contagem padrão em placa são:
1.	Somente células viáveis são contadas;
2.	Permite o isolamento das colônias, que podem ser sub-cultivadas em culturas puras, as quais podem ser facilmente estudadas e identificadas.

No entanto, algumas desvantagens são apresentadas:
1.	Não existe um meio que permita o crescimento de todos os microrganismos;
2.	É necessária a incubação apropriada para permitir o desenvolvimento das colônias;
3.	Usa-se muita vidraria e é relativamente trabalhoso;
4.	A necessidade de muita manipulação pode originar erros nas contagens devido a erros de diluição e/ou plaqueamento.